Teknik Pewarnaan

PEWARNAAN (Staining)

Pewarnaan (stainning) merupakan pemberian warna pada jaringan/ sel/ komponennya supaya mudah diamati di bawah mikroskop cahaya. Zat warna yang digunakan harus memiliki syarat sebagai berikut: senyawa organik kompleks punya pembawaan khusus (warna), dapat dipertahankan dalam jaringan, terdiri dari gugus chromophore.

Tiap bagian dari sel / komponen dalam sel mempunyai sifat- sifat khusus (afinitas terhadap zat warna juga tidak sama). Zat warna mempunyai kemampuan khusus dalam mewarnai jaringan sesuai sifatnya. Dua macam zat warna denga sifat sama dapat mempengaruhi/ memberi kemampuan tidak sama dalam mewarnai 1 macam jaringan (perlu mengenali setiap bagian dari sel & mengenali setiap zat warna yg akan digunakan).

Pembagian Zat Warna

·         Berdasar sifatnya :

- Zat warna asam , misalnya acid fuchsin, eosin.

- Zat warna basa, misalnya hematoxylin, basic fuchsin.

·         Berdasar asalnya:

- Zat warna alam, yaitu zat warna yang diperoleh dari tumbuhan atau hewan, misalnya hematoxylin (dari tumbuhan), carmin dan kokineal (dari hewan).

- Zat warna sintetis, yaitu zat warna yg dibuat di pabrik, misalnya basic fuchsin.

Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin:

- Deparafinasi dengan xylene

- Kelebihan xylene diisap dengan kertas filter melalui tepi gelas benda.

- Celup sebentar dalam alkohol 96%, kemudian 80%, 70%, 50%, 30%, aquadest.

- Masukkan kedalam larutan Hematoxylin dengan waktu tertentu : 3-7 detik.

- Air mengalir : 10 menit. Cuci aquadest sebentar.

- Masukkan sebentar saja berturut-turut mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%.

- Kemudian kedalam larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) 1-3 menit.

- Pewarnaan selesai, tetapi jaringan tidak dapat ditutup langsung dengan Canada balsam,

 karena Canada balsam dilarutkan dalam xylene, sedangkan jaringan masih berada dalammedia alkohol 70% sehingga jaringan harus dibawa ke media xylene dulu.
- Dari larutan eosin 0,5% (dalam alkohol 70%) selanjutnya berturut-turut masukkan ke alkohol 70%, 80%, 96%, alkohol absolut, masing-masing sebentar saja.

- Masukkan xylene ± 10 menit (xylene berfungsi untukl mengantar ke canada balsam juga berfungsi untuk menjernihkan jaringan yang sudah terpulas).

- Jarigan ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu.

Macam-macam Staining (pewarnaan) Bakteriologi

Berikut ini adalah macam - macam pewarnaan bakteri untuk melihat atau mengidentifikasi bakteri secara mikroskopis. Sebenarnya yang sering digunakan adalah pengecatan gram namun tidak ada salahnya jika mempelajari pewarnan lainnya agar lebih spesifik jika ingin meng indentifikasi bakteri semoga bermanfaat.

1.      Pewarnaan Negatif

Tujuan : Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna pewarna sederhana.

Prinsip : Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

Bahan : Biakan pada agar nutrient miring umur 24 jam bakteri Escherichia coli,Bacillus cereus,dan staphylococcus aureus.

Reagensia : Nigrosin atau tinta India

2.      Pewarnaan Sederhana

Tujuan : Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri bakteri.

Prinsip : Pada pewarnaan sederhana,bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogenPerlu diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang digunakan.Untuk karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan Methilen Blue 1-2 menit

Bahan : Biakan pada agar nutrient miring umur 24 jam bakteri Escherichia coli,Bacillus cereus,dan staphylococcus aureus.

Reagensia

Methylen Blue,Kristal violet,dan Karbol Fuchsin.

3.      Pewarnaan Gram

Tujuan : Mempelajari prosedur pewarnaan Gram,memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur tsb,dan secara umum memahami reaksi reaksi kimiawi yang terlibat di dalam proses tersebut.

Prinsip : Bakteri dengan pewrna utama (Primary stain) yaitu dengan kristal violet atau Gentian violet akan berwarna ungu,melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan pelekatan warna utama,penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna utama sehingga pada sel Gram negatif sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel Gram positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu.pada pemberian pewarna tandingan (counterstain) yang berbeda dengan pewarna utama yaitu safranin menyebabkan bakteri gram negatif akan menyerap warna tsb menjadi merah.

Bahan : Kultur bakteri Escherichia coli,Staphylococcus aureus,dan Bacillus cereus(umur 24 jam) pada agar nutrien miring

Reagensia : 

•Kristal violet

•Lugol

•Alkohol 95 %

•Safranin

4.      Pewarnaan Tahan asam

Tujuan : Mempelajari dasar dasar kimiawi pada reaksi tahan asam dan kinerja prosedur pewarnaan tahan asam untuk membedakan bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.

Prinsip : Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna utama (karbol fuchsin) melalui pemberian larutan pemucat (asam alkohol) bakteri tahan asam tetap berwarna merah sedangkan pada bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada penambahan warna kedua (Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru).

Bahan : 

Biakan berumur 24-48 jam :

Mycobacterium Sp,S.aureus dalam TSB

Reagensia : 

Karbol fuchsin

Asam Alkohol

Methylen Blue

5.      Pewarnaan Spora

Tujuan : Mengenal dasar dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif.

Prinsip : Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui pendinginan warna utama akan terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan berwarna merah.

Bahan : 

Biakan berumur 48-72 jam

Bacillus cereus dalam agat nutrien miring

Clostridium butyricum dalam Tioglikolat

6.      Pewarnaan Granula

Tujuan : Mempelajari dasar dasr kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan granula.

Bahan : Corynebacterium diphtheriae dalam agar Loeffler

Reagensia : 

Toluidin blue

Malachite Green

Methylen blue

Kristal violet

Krisoidin

Alkohol 95 %

7.      Pewarnaan Kapsul

Tujuan : Balajar melakukan prosedur pewarnaan kapsul bakteri

Bahan : Klebsiella pneumoniae berumur 36 jam dalam media cair.

Reagensia : 

Kristal violet

CuSO4.5H2O 20 %

Methylen Blue atau Safranin

8.      Pewarnaan Flagella

Tujuan : Mempelajari dasar dasar kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan flagella

Bahan : Biakan Proteus vulgaris dan Pseudomonas aeruginosa.

Reagensia : 

Kristal volet

Asam alkohol

Pewarna flagella-Gray